Gratias tibi ago quod nature.com invisisti. Versio navigatri quam uteris limitatam sustentationem CSS habet. Pro optima experientia, commendamus ut recentissima versione navigatri utaris (vel modum compatibilitatis in Internet Explorer debilites). Praeterea, ut continua sustentatio praestetur, hic situs a stylis et JavaScript carebit.
Musculus sceletalis est textus heterogeneus praecipue ex myofibrillis compositus, quae in hominibus typice in tres typos classificantur: unum "tardum" (typus 1) et duos "celeres" (typos 2A et 2X). Attamen heterogeneitas inter et intra typos myofibrillarum traditionales adhuc parum intellecta manet. Methodos transcriptomicas et proteomicas ad 1050 et 1038 myofibrillas singulas ex vasto laterali humano, respective, adhibuimus. Studium proteomicum viros, et studium transcriptomicum decem viros et duas feminas inclusit. Praeter isoformas catenae gravis myosini, proteinas metabolicas, proteinas ribosomales, et proteinas junctionales cellulares ut fontes variabilitatis intermyofibrillarum multidimensionalis identificavimus. Praeterea, quamvis greges fibrarum tardarum et celerium identificati sint, nostra data suggerunt fibras typi 2X phenotypice indistinguibiles esse ab aliis fibris celeriter contractis. Insuper, classificatio secundum catenam gravem myosini insufficiens est ad describendum phaenotypum myofibrarum in myopathiis nemalinis. Summa summarum, nostra data heterogeneitatem myofibrarum multidimensionalem suggerunt, cum fontibus variationis ultra isoformas catenae gravis myosini extensae.
Heterogeneitas cellularis est proprietas innata omnium systematum biologicorum, permittens cellulis specializari ad varias necessitates textuum et cellularum implendas.1 Visus traditionalis de heterogeneitate fibrarum musculi sceletalis fuit neurona motoria genus fibrae intra unitatem motoriam definire, et genus fibrae (id est, typus 1, typus 2A, et typus 2X in hominibus) determinari a characteristicis isoformarum catenae gravis myosini (MYH).2 Hoc initialiter in instabilitate pH ATPase fundatum est,3,4 et postea in expressione moleculari MYH.5 Attamen, cum identificatione et subsequenti acceptatione fibrarum "mixtarum" quae MYH multiplices in variis proportionibus co-exprimunt, fibrae musculi sceletalis magis magisque videntur ut continuum potius quam ut distincta genera fibrarum.6 Nihilominus, campus adhuc multum nititur MYH ut classificatore primario pro classificatione myofibrarum, opinio probabiliter influta limitationibus et praejudiciis significantibus studiorum primorum in muribus quorum perfiles expressionis MYH et series generum fibrarum differunt ab illis in hominibus.2 Situatio ulterius complicata est eo quod diversi musculi sceletalis humani seriem diversam generum fibrarum exhibent.7 Vastus lateralis est musculus mixtus cum profilo expressionis MYH intermedio (et ideo repraesentativo). Praeterea, facilitas selectionis eum facit musculum in hominibus optime studiatum.
Ergo, investigatio sine praejudicio diversitatis fibrarum musculi sceletalis utens instrumentis "omicis" potentibus est critica sed etiam difficilis, partim propter naturam multinucleatam fibrarum musculi sceletalis. Attamen, technologiae transcriptomica8,9 et proteomica10 revolutionem in sensibilitate annis proximis subierunt propter varios progressus technologicos, permittentes analysin musculi sceletalis ad resolutionem fibrae singularis. Propterea, progressus significans factus est in describenda diversitate fibrae singularis et responsione earum ad stimulos atrophicos et senescentem11,12,13,14,15,16,17,18. Magni momenti est quod hi progressus technologici applicationes clinicas habent, permittentes describendam accuratiorem et uberiorem dysregulationis morbo conexae. Exempli gratia, pathophysiologia myopathiae nemalinae, unius ex morbis musculis hereditariis communissimis (MIM 605355 et MIM 161800), est complexa et confusa.19,20 Ergo, melior describenda dysregulationis fibrarum musculi sceletalis ad progressus significantes in nostra intellegentia huius morbi ducere potest.
Methodos ad transcriptomicam et proteomicam fibrarum singularum musculorum sceletalium, manu ex speciminibus biopsiae humanae isolatarum, elaboravimus et eas ad milia fibrarum applicuimus, quod nobis permisit heterogeneitatem cellularem fibrarum musculorum sceletalium humanarum investigare. Per hoc opus, vim phaenotypationis transcriptomicae et proteomicae fibrarum musculorum demonstravimus et proteinas metabolicas, ribosomales, et junctionales cellulares ut fontes significantes variabilitatis interfibrarum identificavimus. Praeterea, hoc opere proteomico utentes, momentum clinicum myopathiae nematodicae in fibris singularibus musculorum sceletalium descripsimus, mutationem coordinatam versus fibras non oxidativas, independentem a genere fibrae, secundum myopathiam myopathicam myopathicam (MYH) revelantes.
Ad heterogeneitatem fibrarum musculorum sceletalium humanorum investigandam, duos cursus operis elaboravimus ad analysin transcriptomatis et proteomis singularum fibrarum musculorum sceletalium efficiendam (Figura 1A et Figura Suppletoria 1A). Complures gradus methodologicos elaboravimus et optimizavimus, a conservatione exemplorum et preservatione integritatis RNA et proteini ad optimizationem productionis pro singulis methodis. Ad analysin transcriptomatis, hoc effectum est inserendo codices moleculares specificos exemplorum in gradu initiali transcriptionis reversae, quod permisit ut 96 fibrae in unum colligerentur ad efficientem processum subsequentem. Sequentiatio profundior (±1 decies centena milia lectionum per fibram) comparata cum methodis singularum cellularum traditis data transcriptomatis ulterius locupletavit.21 Ad proteomicam, breve gradientem chromatographicum (21 minuta) coniunctum cum acquisitione datorum DIA-PASEF in spectrometro massae timsTOF usi sumus ad profunditatem proteomis optimizandam, magna productione servata. 22,23 Ad heterogeneitatem fibrarum musculorum sceletalium sanarum investigandam, transcriptomas 1050 fibrarum singularium ex 14 donatoribus adultis sanis et proteomas 1038 fibrarum ex 5 donatoribus adultis sanis descripsimus (Tabula Supplementaria 1). In hoc scripto, hae collectiones datorum transcriptomas 1000 fibrarum et proteomas, respective, appellantur. Nostra methodus in summa 27237 transcripta et 2983 proteinas in analysibus transcriptomicis et proteomicis 1000 fibrarum detexit (Figura 1A, Collectiones Datorum Supplementariae 1-2). Post filtrationem collectionum transcriptomicarum et proteomicarum pro >1000 genis detectis et 50% valoribus validis per fibram, subsequentes analyses bioinformaticae pro 925 et 974 fibris in transcriptoma et proteoma, respective, peractae sunt. Post filtrationem, media 4257 ± 1557 gena et 2015 ± 234 proteina (media ± deviatio standardis) per fibram detecta sunt, cum variabilitate interindividuali limitata (Figurae Supplementariae 1B-C, Collectiones Datorum Supplementariae 3-4). Attamen, variabilitas intra subiecta magis insignis erat inter participes, probabiliter propter differentias in productione RNA/proteini inter fibras diversarum longitudinum et arearum sectionis transversalis. Pro plerisque proteinis (>2000), coefficiens variationis infra 20% erat (Figura Supplementaria 1D). Ambae methodi permiserunt capere latam seriem dynamicam transcriptorum et proteinorum cum signaturis valde expressis magni momenti ad contractionem musculorum (e.g., ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Figurae Supplementariae 1E-F). Pleraque notae identificatae communes erant inter datasets transcriptomica et proteomica (Figura Supplementaria 1G), et mediae intensitates UMI/LFQ harum notarum satis bene correlatae erant (r = 0.52) (Figura Supplementaria 1H).
Processus processus transcriptomicae et proteomicae (creatus cum BioRender.com). BD Curvae amplitudinis dynamicae pro MYH7, MYH2, et MYH1, et limina calculata pro assignatione typi fibrae. E, F Distributio expressionis MYH per fibras in collectionibus transcriptomicae et proteomicae. G, H Diagrammata Approximationis et Projectionis Diversitatis Uniformis (UMAP) pro transcriptomica et proteomica colorata secundum typum fibrae MYH fundatum. I, J Diagrammata lineamentorum ostendentia expressionem MYH7, MYH2, et MYH1 in collectionibus transcriptomicae et proteomicae.
Initio proposuimus ut fibrae singulas fibras genus fibrae MYH fundatum assignaremus, methodo optima utentes, quae commodis sensitivitatis altae et amplitudinis dynamicae expressionis MYH in collectionibus datorum omicorum utitur. Studia priora limina arbitraria adhibuerunt ad fibras designandas ut typum purum 1, typum 2A, typum 2X, vel mixtas, secundum fixam expressionis MYH diversarum11,14,24. Methodo diversa usi sumus, in qua expressio cuiusque fibrae secundum MYH quas ad fibras typandas usi sumus ordinata est: MYH7, MYH2, et MYH1, quae fibris typo 1, typo 2A, et typo 2X respective respondent. Deinde punctum inflectionis inferius cuiusque curvae resultantis mathematice calculavimus et id ut limen adhibuimus ad fibras assignandas ut positivas (supra limen) vel negativas (infra limen) pro singulis MYH (Figura 1B-D). Haec data demonstrant MYH7 (Figura 1B) et MYH2 (Figura 1C) perfiles expressionis on/off distinctiores in gradu RNA comparatis cum gradu proteini habere. Sane, in gradu proteini, perpaucae fibrae MYH7 non expresserunt, et nulla fibra 100% expressionem MYH2 habuit. Deinde limina expressionis praefinita usi sumus ad genera fibrarum MYH fundatarum omnibus fibris in unoquoque indice assignanda. Exempli gratia, fibrae MYH7+/MYH2-/MYH1- typo 1 assignatae sunt, dum fibrae MYH7-/MYH2+/MYH1+ typo mixto 2A/2X assignatae sunt (vide Tabulam Supplementarem 2 pro descriptione plena). Omnes fibras congregantes, distributionem insigniter similem generum fibrarum MYH fundatarum tam in gradu RNA (Figura 1E) quam in proteino (Figura 1F) observavimus, dum compositio relativa generum fibrarum MYH fundatarum inter individua variabat, ut expectatum (Figura Supplementaris 2A). Pleraeque fibrae vel ut purae typi 1 (34–35%) vel ut typi 2A (36–38%) classificatae sunt, quamquam numerus significans fibrarum mixtarum typi 2A/2X etiam detectus est (16–19%). Differentia insignis est quod fibrae purae typi 2X tantum in gradu RNA, sed non in gradu proteini, detegi potuerunt, quod suggerit rapidam expressionem MYH saltem partim post-transcriptionalem regulari.
Methodum nostram fibrarum MYH typandarum, proteomica fundatam, per "dot blotting" anticorporum fundatam comprobavimus, et ambae methodi consensum 100% in fibris puris typi 1 et typi 2A identificandis consecuti sunt (vide Figuram Supplementarem 2B). Attamen, methodus proteomica fundata sensitivior et efficacior erat in fibris mixtis identificandis, et proportione cuiusque geni MYH in unaquaque fibra quantificanda. Haec data efficaciam demonstrant methodi obiectivae, omicae fundatae valde sensibilis, ad genera fibrarum musculorum sceletalium describenda.
Deinde, informatione a transcriptomica et proteomica provisa coniuncta, usi sumus ad myofibras obiective classificandas secundum transcriptoma vel proteoma completum. Methodo approximationis et projectionis varii uniformis (UMAP) adhibita, ad dimensionalitatem ad sex componentes principales reducendam (Figurae Supplementariae 3A-B), variabilitatem myofibrarum in transcriptoma (Figura 1G) et proteoma (Figura 1H) visualizare potuimus. Notandum est myofibras non secundum participes (Figurae Supplementariae 3C-D) nec secundum dies probationis (Figura Supplementaria 3E) in collectionibus transcriptomicae nec proteomicae congregatas esse, quod suggerit variabilitatem intra subiecta in fibris musculorum sceletalium maiorem esse quam variabilitatem inter subiecta. In graphico UMAP, duo coetus distincti myofibras "celerosas" et "tardas" repraesentantes emerserunt (Figurae 1G-H). Fibrae myofibrae MYH7+ (tardae) in polo positivo UMAP1 congregatae sunt, dum fibrae myofibrae MYH2+ et MYH1+ (celeres) in polo negativo UMAP1 congregatae sunt (Figurae 1I-J). Nihilominus, nulla distinctio facta est inter genera fibrarum celeris contractionis (i.e., typus 2A, typus 2X, vel mixtae 2A/2X) secundum expressionem MYH, quod suggerit expressionem MYH1 (Figura 1I-J) vel alia indicia myofibrarum 2X classica, ut ACTN3 vel MYLK2 (Figurae Supplementariae 4A-B), non distinguere inter genera myofibrarum diversa cum totum transcriptoma vel proteoma consideratur. Praeterea, comparatis cum MYH2 et MYH7, paucae transcriptae vel proteinae positive correlatae sunt cum MYH1 (Figurae Supplementariae 4C-H), quod suggerit abundantiam MYH1 non plene transcriptoma/proteoma myofibrarum reflectere. Similes conclusiones pervenerunt cum expressio mixta trium isoformarum MYH in gradu UMAP aestimaretur (Figurae Supplementares 4I-J). Itaque, dum fibrae 2X in gradu transcripto identificari possunt sola quantificatione MYH, fibrae MYH1+ non distinguuntur ab aliis fibris celeribus cum totum transcriptoma vel proteoma consideratur.
In exploratione initiali heterogeneitatis fibrarum tardarum ultra MYH, quattuor proteinas fibrarum tardarum specificas ad genus specificarum investigavimus: TPM3, TNNT1, MYL3, et ATP2A22. Subtypi fibrarum tardarum correlationes Pearsonianas altas, quamvis non perfectas, cum MYH7 et in transcriptomica (Figura Supplementaria 5A) et in proteomica (Figura Supplementaria 5B) ostenderunt. Circiter 25% et 33% fibrarum tardarum non ut fibrae tardae purae ab omnibus subtypis genorum/proteinorum in transcriptomica (Figura Supplementaria 5C) et proteomica (Figura Supplementaria 5D) respective classificatae sunt. Ergo, classificatio fibrarum tardarum secundum subtypos genorum/proteinorum multiplices complexitatem additam inducit, etiam pro proteinis quae scimus esse specificae ad genus fibrarum. Hoc suggerit classificationem fibrarum secundum isoformas unius familiae genorum/proteinorum fortasse non satis veram heterogeneitatem fibrarum musculorum sceletalium reflectere.
Ut variabilitatem phenotypicam fibrarum musculorum sceletalium humanorum ad scalam totius exemplaris omici ulterius exploraremus, reductionem dimensionalitatis imparcialem datorum per analysin principalium componentium (PCA) effecimus (Figura 2A). Similiter ac in graphicis UMAP, neque participantis neque dies probationis congregationem fibrarum ad gradum PCA moverunt (Figurae Supplementariae 6A-C). In utroque datorum grege, genus fibrae MYH fundatum per PC2 explicatum est, quod gregem fibrarum typi 1 contractionis lentae et gregem secundum fibras typi 2A, typi 2X, et mixtas 2A/2X ostendit (Figura 2A). In utroque datorum grege, hi duo greges paucis fibrarum mixtarum typi 1/2A connexi erant. Ut expectatum, analysis superrepraesentationis impulsorum PC principalium confirmavit PC2 a signaturis contractilibus et metabolicis impelli (Figura 2B et Figurae Supplementariae 6D-E, Datorum Greges Supplementariae 5-6). Summa summarum, genus fibrae MYH-fundatum sufficiens inventum est ad variationem continuam secundum PC2 explicandam, exceptis fibris sic dictaj 2X quae per transcriptomum intra gregem celerem distributae sunt.
A. Diagrammata analysis principalis componentium (PCA) collectionum transcriptomatum et proteomatum coloratarum secundum genus fibrae in MYH fundatarum. B. Analysis locupletationis impulsorum transcriptionum et proteinorum in PC2 et PC1. Analysis statistica peracta est utens fasciculo clusterProfiler et valoribus p Benjamini-Hochberg adaptatis. C, D. Diagrammata PCA colorata secundum terminos ontologiae geni adhaesionis intercellularis (GO) in transcriptoma et terminos GO costamerorum in proteoma. Sagittae impulsores transcriptionum et proteinorum eorumque directiones repraesentant. E, F. Diagrammata lineamentorum approximationis et projectionis uniformis varii (UMAP) lineamentorum clinicē pertinentium ostendentium gradientes expressionis independentes a genere fibrae tardae/celeris. G, H. Correlationes inter impulsores PC2 et PC1 in transcriptomatibus et proteomatibus.
Inopinato modo, myofibrae genus MYH fundatum tantum secundum altissimum gradum variabilitatis (PC2) explicavit, quod indicat alios factores biologicos, qui ad myofibram MYH fundatam (PC1) non pertinent, partes magnas agere in heterogeneitate fibrarum musculi sceletalis regulanda. Analysis superrepraesentationis factorum praecipuorum in PC1 revelavit variabilitatem in PC1 imprimis determinatam esse ab adhaesione cellulae inter cellulas et contento ribosomatum in transcriptoma, et costameris et proteinis ribosomialibus in proteoma (Figura 2B et Figurae Supplementariae 6D-E, Series Datorum Supplementaria 7). In musculo sceletali, costameri discum Z cum sarcolemma connectunt et in transmissione et signalatione virium implicantur. 25 Diagrammata PCA annotata utens adhaesione cellulae inter cellulas (transcriptoma, Figura 2C) et costameris (proteoma, Figura 2D) fortem translationem ad sinistram in PC1 revelaverunt, quod indicat has proprietates in certis fibris locupletatas esse.
Examen accuratius coacervationis myofibrarum in gradu UMAP revelavit plerasque proprietates gradientem expressionis MYH fundatum in myofibra, a typo myofibrae independentem, potius quam subaggregatione myofibrae specificam, exhibere. Haec continuitas observata est in pluribus genis cum condicionibus pathologicis consociatis (Figura 2E), ut CHCHD10 (morbus neuromuscularis), SLIT3 (atrophia musculorum), CTDNEP1 (morbus musculorum). Haec continuitas etiam per proteoma observata est, inclusis proteinis cum perturbationibus neurologicis consociatis (UGDH), signalatione insulini (PHIP), et transcriptione (HIST1H2AB) (Figura 2F). Communiter, haec data continuitatem in heterogeneitate contractionis lentae/celerosae a typo fibrae independente per myofibras diversas indicant.
Curiose, gena impulsoria in PC2 bonam correlationem transcriptomae-proteomae demonstraverunt (r = 0.663) (Figura 2G), quod suggerit fibras tardas et celeres, et praesertim proprietates contractiles et metabolicas fibrarum musculorum sceletalium, transcriptionaliter regulari. Attamen, gena impulsoria in PC1 nullam correlationem transcriptomae-proteomae demonstraverunt (r = -0.027) (Figura 2H), quod suggerit variationes non pertinentes ad fibras tardas/celestas plerumque post-transcriptionaliter regulari. Quia variationes in PC1 imprimis per terminos ontologiae genorum ribosomalis explicabantur, et cum ribosomata munus cruciale et specializatum in cellula agant, active participando in translatione proteinorum et eam influendo,31 deinde hanc heterogeneitatem ribosomalem inexpectatam investigare voluimus.
Primum graphum analysis principalis componentium proteomicarum secundum abundantiam relativam proteinorum in termino GOCC "ribosoma cytoplasmicum" (Figura 3A) coloravimus. Quamquam hic terminus in latere positivo PC1 locupletatus est, quod parvum gradientum efficit, proteinae ribosomales partitionem in utramque directionem PC1 impellunt (Figura 3A). Proteinae ribosomales in latere negativo PC1 locupletatae RPL18, RPS18, et RPS13 comprehendunt (Figura 3B), dum RPL31, RPL35, et RPL38 (Figura 3C) impulsores principales in latere positivo PC1 fuerunt. Curiose, RPL38 et RPS13 in musculo sceletali valde expressae sunt comparatae cum aliis textibus (Figura Supplementaria 7A). Hae signaturae ribosomales distinctae in PC1 in transcriptoma non observatae sunt (Figura Supplementaria 7B), quod regulationem post-transcriptionalem indicat.
A. Diagramma analysis principalis componentium (PCA) secundum terminos ontologiae genorum ribosomalis cytoplasmaticorum (GO) per proteoma coloratum. Sagittae directionem variationis proteino-mediatae in diagramma PCA indicant. Longitudo lineae cum punctis principalis componentium pro dato proteino respondet. B, C. Diagrammata linearum PCA pro RPS13 et RPL38. D. Analysis hierarchica coacervationis non supervisata proteinorum ribosomalis cytoplasmaticorum. E. Modellum structurale ribosomatis 80S (PDB: 4V6X) proteinas ribosomales cum abundantia diversa in fibris musculi sceletalis illustrans. F. Proteina ribosomalis cum stoichiometria diversa prope canalem exitus mRNA localizata.
Notiones heterogeneitatis et specializationis ribosomalis antea propositae sunt, quibus praesentia distinctarum subpopulationum ribosomatum (heterogeneitas ribosomalis) translationem proteinorum in diversis textibus32 et cellulis33 directe afficere potest per translationem selectivam specificorum gregum transcriptionum mRNA34 (specialisationem ribosomatum). Ad subpopulationes proteinorum ribosomalum co-expressorum in fibris musculorum sceletalium identificandas, analysin aggregationis hierarchicae sine supervisione proteinorum ribosomalum in proteoma perfecimus (Figura 3D, Supplementary Data Set 8). Ut expectatum, proteina ribosomalia non secundum genus fibrae secundum MYH congregata sunt. Tamen, tres greges distinctos proteinorum ribosomalum identificavimus; primus grex (ribosomal_cluster_1) cum RPL38 coregulatur et ergo expressionem auctam in fibris cum profilo PC1 positivo habet. Secundus grex (ribosomal_cluster_2) cum RPS13 coregulatur et in fibris cum profilo PC1 negativo elevatur. Tertius grex (grex_ribosomalis_3) expressionem differentialem coordinatam in fibris musculi sceletalis non ostendit et pro proteina ribosomali "centrali" musculi sceletalis considerari potest. Ambi greges ribosomales 1 et 2 proteina ribosomalia continent quae antea demonstrata sunt translationem alternativam moderari (e.g., RPL10A, RPL38, RPS19, et RPS25) et functionaliter evolutionem afficere (e.g., RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Congruenter cum resultatis PCA, repraesentatio heterogenea observata harum proteinarum ribosomalis per fibras etiam continuitatem ostendit (Figura Supplementaria 7C).
Ad situm proteinorum ribosomalum heterogeneorum intra ribosoma visualizandum, exemplar structurale ribosomi humani 80S (Protein Data Bank: 4V6X) (Figura 3E) usi sumus. Post isolationem proteinorum ribosomalum ad diversos greges ribosomales pertinentium, loca earum non arcte congruentia erant, quod suggerit nostram methodum non potuisse locupletare certas regiones/fractiones ribosomi. Curiose autem, proportio proteinorum subunitatum magnarum in grege 2 inferior erat quam in gregibus 1 et 3 (Figura Suppletoria 7D). Observavimus proteinas cum stoichiometria mutata in fibris musculi sceletalis praesertim ad superficiem ribosomatis locatas esse (Figura 3E), quod congruit cum facultate earum interagendi cum elementis internis situs ingressus ribosomatis (IRES) in diversis populationibus mRNA, ita translationem selectivam coordinando. 40, 41 Praeterea, multae proteinae cum stoichiometria mutata in fibris musculi sceletalis prope regiones functionales, ut cuniculum exitus mRNA (Figura 3F), sitae erant, quae selective elongationem translationis et arrestationem peptidorum specificorum regulant. 42 Summa summarum, nostra data suggerunt stoichiometriam proteinorum ribosomalis musculi sceletalis heterogeneitatem exhibere, quae differentias inter fibras musculi sceletalis efficit.
Deinde signaturas fibrarum celeris et tardae contractionis identificare et mechanismos earum regulationis transcriptionalis explorare proposuimus. Comparantes fasciculos fibrarum celeris et tardae contractionis a UMAP in duobus collectionibus datorum (Figurae 1G-H et 4A-B), analyses transcriptomicae et proteomicae 1366 et 804 notas differentialiter abundantes, respective, identificaverunt (Figurae 4A-B, Collectiones Datorum Supplementariae 9-12). Differentias exspectatas in signaturis ad sarcomera (e.g., tropomyosinum et troponinum), copulationem excitationis-contractionis (isoformae SERCA), et metabolismum energiae (e.g., ALDOA et CKB) pertinentibus observavimus. Praeterea, transcripta et proteina ubiquitinationem proteinorum regulantia differentialiter expressa sunt in fibris celeris et tardae contractionis (e.g., USP54, SH3RF2, USP28, et USP48) (Figurae 4A-B). Praeterea, genum proteini microbialis RP11-451G4.2 (DWORF), quod antea demonstratum est differentialiter expressum esse per genera fibrarum musculorum agninorum43 et actionem SERCA in musculo cardiaco auget44, significanter auctum est in fibris musculorum sceletalis lentis (Figura 4A). Similiter, in gradu singularum fibrarum, differentiae significantes observatae sunt in notis signaturis, ut isoformis lactati dehydrogenasis metabolismo relatis (LDHA et LDHB, Figura 4C et Figura Suppletoria 8A)45,46 necnon signaturis antea ignotis specificis typi fibrae (ut IRX3, USP54, USP28, et DPYSL3) (Figura 4C). Implicatio significativa proprietatum differentialiter expressarum inter collectiones transcriptomicas et proteomicas observata est (Figura Suppletoria 8B), necnon correlatio mutationis plicarum praecipue impulsa expressione differentiali pronuntiatiore proprietatum sarcomerorum (Figura Suppletoria 8C). Notandum est nonnullas signaturas (e.g., USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) validam regulationem post-transcriptionalem tantum in gradu proteomico demonstravisse et perfiles expressionis fibrarum contractionis tardae/celerosae secundum genus specificas habere (Figura Supplementaria 8C).
Diagrammata vulcanorum A et B, quae congeries tardas et celeres comparant, per diagrammata approximationis et projectionis uniformis varii (UMAP) in Figuris 1G-H identificata. Puncta colorata transcripta vel proteina repraesentant quae significanter differunt ad FDR < 0.05, et puncta obscuriora transcripta vel proteina repraesentant quae significanter differunt ad mutationem logarithmicam > 1. Analysis statistica bidirectionalis peracta est utens probatione DESeq2 Wald cum valoribus p Benjamini-Hochberg adaptatis (transcriptomica) vel methodo exemplaris linearis Limma cum analysi Bayesiana empirica secuta adaptatione Benjamini-Hochberg pro comparationibus multiplicibus (proteomica). C Diagrammata signaturae genorum vel proteinorum differentialiter expressorum selectorum inter fibras tardas et celeres. D Analysis locupletationis transcriptarum et proteinorum significanter differentialiter expressorum. Valores inter se imbricati locupletantur in utroque dataset, valores transcriptomae locupletantur solum in transcriptoma, et valores proteomae locupletantur solum in proteoma. Analysis statistica peracta est utens fasciculo clusterProfiler cum valoribus p Benjamini-Hochberg adaptatis. E. Factores transcriptionis fibrae proprii a SCENIC identificati, fundati in indicibus specificitatis regulatoris a SCENIC derivatis et expressione mRNA differentiali inter genera fibrarum. F. Delineatio factorum transcriptionis selectorum differentialiter expressorum inter fibras tardas et celeres.
Deinde analysin superrepraesentationis genorum et proteinorum differentiter repraesentatorum perfecimus (Figura 4D, Series Datorum Supplementorum 13). Ditatio semitarum pro notis quae inter duas series datorum differunt differentias exspectatas revelavit, ut processus β-oxidationis acidorum pinguium et metabolismi ketonorum (fibrae tardae), contractionem myofilamentorum/musculorum (fibrae celeres et tardae, respective), et processus catabolicos carbohydratorum (fibrae celeres). Actio phosphatasis proteini serini/threonini etiam in fibris celeribus elevata est, impulsa a notis ut subunitates phosphatasis regulatoriae et catalyticae (PPP3CB, PPP1R3D, et PPP1R3A), quae metabolismum glycogeni moderari notae sunt (47) (Figurae Supplementorum 8D-E). Aliae viae fibris celeribus locupletatae corpora (P-) processuum (YTHDF3, TRIM21, LSM2) in proteoma (Figura Suppletoria 8F), potentialiter implicata in regulatione post-transcriptionali (48), et activitate factorum transcriptionis (SREBF1, RXRG, RORA) in transcriptoma (Figura Suppletoria 8G) comprehendunt. Fibrae tardae locupletatae sunt activitate oxidoreductasis (BDH1, DCXR, TXN2) (Figura Suppletoria 8H), ligatione amidi (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Figura Suppletoria 8I), matrice extracellulari (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Figura Suppletoria 8J), et activitate ligandorum receptoris (FNDC5, SPX, NENF) (Figura Suppletoria 8K).
Ut ulterius perspiceremus ordinationem transcriptionis quae subiacet notis fibrarum musculorum tardarum/velocium, analysin locupletationis factorum transcriptionis per SCENIC49 (Supplementary Data Set 14) perfecimus. Multi factores transcriptionis inter fibras musculorum celeres et tardas significanter locupletati sunt (Figura 4E). Hoc comprehendit factores transcriptionis ut MAFA, qui antea cum evolutione fibrarum musculorum celeris coniunctus est,50 necnon plures factores transcriptionis non antea cum programmatibus genorum specificis fibrarum musculorum coniuncti. Inter hos, PITX1, EGR1, et MYF6 erant factores transcriptionis maxime locupletati in fibris musculorum celeribus (Figura 4E). Contra, ZSCAN30 et EPAS1 (etiam HIF2A appellatus) erant factores transcriptionis maxime locupletati in fibris musculorum lentis (Figura 4E). Hoc congruenter, MAFA in altioribus gradibus in regione UMAP fibris musculorum celeribus correspondenti expressus est, dum EPAS1 exemplar expressionis oppositum habuit (Figura 4F).
Praeter gena nota proteinorum codificantia, multae biotypae RNA non codificantiae exstant quae in ordinatione progressionis humanae et morborum implicatae esse possunt.51, 52 In collectionibus datorum transcriptomatum, plura RNA non codificantia specificitatem typi fibrae exhibent (Figura 5A et Collectiones Datorum Supplementariae 15), incluso LINC01405, quod valde specificum est pro fibris lentis et diminutum esse in musculis aegrotorum cum myopathia mitochondriali refertur.53 Contra, RP11-255P5.3, geni lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2)54 respondens, specificitatem typi fibrae celeris exhibet. Tam LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) quam RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) specificitatem musculi sceletalis exhibent (Figurae Supplementariae 9A-B) et nulla gena contractilia nota intra vicinitatem genomicam 1 Mb habent, quod suggerit ea munus specializatum agere in regulandis generibus fibrarum potius quam in regulandis genis contractilibus vicinis. Profiles expressionis specificae secundum genus fibrarum tardae/celerosae LINC01405 et RP11-255P5.3, respective, confirmatae sunt utens RNAscope (Figurae 5B-C).
A. Transcripta RNA non codificantia in fibris musculorum tardae et celeris contractionis significanter regulantur. B. Imagines RNAscopii repraesentativae specificitatem typi fibrarum tardae et celeris contractionis LINC01405 et RP11-255P5.3, respective, ostendentes. Scala = 50 μm. C. Quantificatio expressionis RNA non codificantis typi myofibrae specificae ut per RNAscope determinata est (n = 3 biopsiae ab individuis independentibus, fibras musculorum celeres et tardas intra unumquemque individuum comparantes). Analysis statistica per test-t Studentis bilateralem peracta est. Diagrammata capsularia medianam et primum ac tertium quartiles ostendunt, cum vibrissibus ad valores minimos et maximos spectantibus. D. Fluxus operis identificationis proteini microbialis de novo (creatus cum BioRender.com). E. Proteinum microbiale LINC01405_ORF408:17441:17358 specifice exprimitur in fibris musculorum sceletalis lentis (n = 5 biopsiae a participantibus independentibus, fibras musculorum celeres et tardas in unoquoque participante comparantes). Analysis statistica peracta est methodo Limm linearis exemplaris coniuncta cum methodo Bayesiana empirica, deinde methodo Benjamini-Hochberg ad comparationes multiplices cum correctione valoris p. Diagrammata capsularia medianam, primum et tertium quartile ostendunt, cum vibrissibus ad valores maximos/minimos spectantibus.
Nuper, studia demonstraverunt multa transcripta putativa non-codificantia proteinas microbiales transcriptas codificare, quarum nonnullae functionem musculorum regulant.44, 55 Ad proteinas microbiales cum potentiali specificitate typi fibrae identificandas, collectionem nostram proteomatis 1000 fibrarum perscrutati sumus utens fasciculo FASTA proprio continenti sequentias transcriptarum non-codificantium (n = 305) in collectione transcriptomatis 1000 fibrarum inventas (Figura 5D). Centum nonaginta septem proteinas microbiales ex viginti duobus transcriptis diversis identificavimus, quarum septuaginta una differentialiter inter fibras musculorum sceletalium tardas et celeres regulabantur (Figura Suppletoria 9C et Collectione Datorum Suppletoria 16). Pro LINC01405, tria producta proteinorum microbialium identificata sunt, quorum unum similem specificitatem fibrae tardae transcripti sui demonstravit (Figura 5E et Figura Suppletoria 9D). Ita, LINC01405 ut genem proteinum microbiale specificum pro fibris musculorum sceletalium tardis codificans identificavimus.
Modum operandi comprehensivum ad proteomicam fibrarum musculorum singularum describendam elaboravimus et regulatores heterogeneitatis fibrarum in statibus sanis identificavimus. Hunc modum operandi adhibuimus ad intellegendum quomodo myopathiae nemalinae heterogeneitatem fibrarum musculorum sceletalium afficiant. Myopathiae nemalinae morbi musculorum hereditarii sunt qui debilitatem musculorum causant et, in pueris affectis, cum variis complicationibus, inter quas angustia respiratoria, scoliosis, et mobilitate membrorum limitata, se praebent. 19,20 Typice, in myopathiis nemalinis, variantes pathologicae in genis ut actin alpha 1 (ACTA1) praedominantiam compositionis myofibrarum fibrarum contractionis tardae efficiunt, quamquam hic effectus heterogeneus est. Una exceptio notabilis est myopathia nemalina troponini T1 (TNNT1), quae praedominantiam fibrarum velocium habet. Ergo, melior intellectus heterogeneitatis subiacentis dysregulationi fibrarum musculorum sceletalium in myopathiis nemalinis observatae adiuvare potest ad explicandam complexam relationem inter hos morbos et genus myofibrarum.
Comparatae cum subiectis sanis (n=3 per gregem), fibrae myoticae ex aegris myopathia nemalina cum mutationibus in genis ACTA1 et TNNT1 isolatae atrophiam vel dystrophiam myofibrarum notabilem ostenderunt (Figura 6A, Tabula Suppletoria 3). Hoc magnas difficultates technicas pro analysi proteomica praebuit propter limitatam quantitatem materiae praesto. Nihilominus, 2485 proteinas in 272 fibris myoticis sceletalibus detegere potuimus. Post filtrationem pro saltem 1000 proteinis quantificatis per fibram, 250 fibrae subsequenti analysi bioinformaticae subiectae sunt. Post filtrationem, mediocris 1573 ± 359 proteinas per fibram quantificatae sunt (Figura Suppletoria 10A, Series Datorum Supplementaria 17-18). Notandum est, quamvis significanter reducta sit magnitudo fibrarum, profunditas proteomis exemplorum aegrotorum myopathia nemalina. Praeterea, per elaborationem harum notitiarum utens nostris propriis fasciculis FASTA (inclusis transcriptionibus non-codificantibus), quinque proteinas microbiales in myofibris sceletalibus a aegris myopathia nemalina laborantibus identificare potuimus (Series Notitiarum Supplementariarum 19). Ambitus dynamicus proteomis significanter latior erat, et proteinae totales in grege comparativo bene cum resultatibus prioris analysis proteomis 1000 fibrarum correlatae sunt (Figura Supplementaria 10B-C).
A. Imagines microscopicae atrophiam vel dystrophiam fibrarum et praedominantiam diversorum generum fibrarum secundum myopathias nemalinas (NM) ACTA1 et TNNT1 ostendentes. Scalae linea = 100 μm. Ad reproducibilitatem colorationis in aegris ACTA1 et TNNT1 curandam, biopsiae trium aegrotorum bis vel ter tinctae sunt (quattuor sectiones per casum) antequam imagines repraesentativae selectae sunt. B. Proportiones generum fibrarum in participantibus secundum MYH. C. Diagramma analysis principalis componentium (PCA) fibrarum musculorum sceletalium in aegris cum myopathiis nemalinis et controlibus. D. Fibrae musculorum sceletalium ab aegris cum myopathiis nemalinis et controlibus proiectae in diagramma PCA determinatum ex 1000 fibris in Figura 2 analysatis. Exempli gratia, diagrammata vulcani differentias inter participes cum myopathiis nemalinis ACTA1 et TNNT1 et controles, et inter participes cum myopathiis nemalinis ACTA1 et TNNT1 comparantia. Circuli colorati proteinas significant quae significanter differebant cum π < 0.05, et puncta nigra proteinas significant quae significanter differebant cum FDR < 0.05. Analysis statistica peracta est utens methodo Limma linearis exemplaris et methodis Bayesianis empiricis, deinde adaptatione valoris p pro comparationibus multiplicibus peracta est methodo Benjamini-Hochberg. H. Analysis locupletationis proteinorum significanter differentialiter expressorum per totum proteoma et in fibris typi 1 et 2A. Analysis statistica peracta est utens fasciculo clusterProfiler et valoribus p Benjamini-Hochberg adaptatis. I, J. Diagrammata analysis componentium principalium (PCA) colorata terminis matrice extracellulari et ontologiae genorum mitochondrialium (GO).
Quia myopathiae nemalinae proportionem myofibrarum MYH exprimentium in musculo sceletali afficere possunt,19,20 primum genera myofibrarum MYH exprimentium in aegrotis cum myopathiis nemalinis et in comparationibus examinavimus. Genus myofibrarum determinavimus utens methodo impartiali antea descripta pro experimento 1000 myofibrarum (Figurae Supplementariae 10D-E) et iterum myofibras puras 2X identificare nequivimus (Figura 6B). Effectum heterogeneum myopathiarum nemalinarum in genus myofibrarum observavimus, cum duo aegroti cum mutationibus ACTA1 proportionem auctam myofibrarum typi 1 habebant, dum duo aegroti cum myopathia nemalina TNNT1 proportionem diminutam myofibrarum typi 1 habebant (Figura 6B). Sane expressio isoformarum MYH2 et troponini celeris (TNNC2, TNNI2, et TNNT3) in myopathiis ACTA1-nemalinis imminuta est, dum expressio MYH7 in myopathiis TNNT1-nemalinis imminuta est (Figura Supplementaria 11A). Hoc congruit cum relationibus prioribus de commutatione heterogenea typi myofibrarum in myopathiis nemalinis.19,20 Haec eventa per immunohistochemiam confirmavimus et invenimus aegros cum myopathia ACTA1-nemalina praedominantiam myofibrarum typi 1 habere, dum aegros cum myopathia TNNT1-nemalina exemplar oppositum habebant (Figura 6A).
In gradu proteomis fibrae singularis, fibrae musculorum sceletalium ex aegrotis myopathia nemalina ACTA1 et TNNT1 cum plurimis fibris controllibus congregatae sunt, fibris myopathiae nemalinae TNNT1 plerumque gravissime affectis (Figura 6C). Hoc praesertim manifestum erat cum delineationes analysis principalis componentium (PCA) fibrarum pseudo-inflatarum pro singulis aegrotis delineabantur, cum aegroti 2 et 3 myopathiae nemalinae TNNT1 distantissimi a exemplaribus controllibus apparentes (Figura Supplementaria 11B, Series Datorum Supplementaria 20). Ut melius intellegeretur quomodo fibrae ex aegrotis myopathiae cum fibris sanis compararentur, informationes accuratas ex analysi proteomica 1000 fibrarum ex participantibus adultis sanis obtentas usi sumus. Fibras ex serie datorum myopathiae (aegris et controllibus myopathia nemalina ACTA1 et TNNT1) in delineationem PCA ex analysi proteomica 1000 fibrarum obtentam proiecimus (Figura 6D). Distributio generum fibrarum MYH secundum PC2 in fibris moderantibus similis erat distributioni fibrarum ex analysi proteomica 1000 fibrarum obtentae. Attamen, pleraeque fibrae in aegris myopathia nemalina deorsum ad PC2 motae sunt, cum fibris sanis celeris-contractionis imbricatae, cuiuscumque generis fibrae MYH nativae essent. Itaque, quamquam aegri cum myopathia nemalina ACTA1 mutationem versus fibras typi 1 ostenderunt cum quantificati sunt methodis MYH fundatis, et myopathia nemalina ACTA1 et myopathia nemalina TNNT1 proteoma fibrarum musculi sceletalis versus fibras celeris-contractionis motaverunt.
Deinde unumquemque gregem aegrotorum cum subiectis sanis directe comparavimus et 256 et 552 proteinas differentialiter expressas in myopathiis nemalinis ACTA1 et TNNT1 respective identificavimus (Figura 6E-G et Figura Suppletoria 11C, Series Datorum Suppletoria 21). Analysis locupletationis genorum decrementum coordinatum in proteinis mitochondrialibus ostendit (Figura 6H-I, Series Datorum Suppletoria 22). Mirum est, quamvis praedominantia differentialis generum fibrarum in myopathiis nemalinis ACTA1 et TNNT1 sit, haec decrementum omnino independens erat a genere fibrae MYH-fundatae (Figura 6H et Figurae Suppletoriae 11D-I, Series Datorum Suppletoria 23). Tres proteinae microbiales etiam in myopathiis nemalinis ACTA1 vel TNNT1 regulatae sunt. Duo ex his microproteinis, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (etiam LINC00598 vel Lnc-FOXO1 appellata) et ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), abundantiam differentialem tantum in myofibris typi 1 ostenderunt. ENSG00000215483_TR14_ORF67 antea relatum est munus agere in regulatione cycli cellularis.56 Ex altera parte, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (LINC01798 respondens) aucta est in myofibris et typi 1 et typi 2A in myopathia ACTA1-nemalina comparata cum subiectis sanis (Figura Supplementaria 12A, Series Datorum Supplementaria 24). Contra, proteina ribosomalia a myopathia nemalina plerumque non affecta sunt, quamquam RPS17 in myopathia nemalina ACTA1 imminuta est (Fig. 6E).
Analysis locupletationis etiam augmentationem processuum systematis immunitatis in myopathiis nemalinis ACTA1 et TNNT1 revelavit, dum adhaesio cellularis etiam aucta est in myopathia nemalinis TNNT1 (Figura 6H). Locupletatio horum factorum extracellularium reflectebatur per proteinos matricis extracellularis PCA in PC1 et PC2 in directionem negativam moventes (i.e., versus fibras maxime affectas) (Figura 6J). Ambo coetus aegrotorum expressionem auctam proteinorum extracellularium implicatorum in responsionibus immunitatis et mechanismis reparationis sarcolemmalis, ut annexinarum (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 et earum proteini interagentis S100A1159 (Figurae Supplementariae 12B-C), demonstraverunt. Hic processus antea relatus est auctus esse in dystrophiis muscularibus60 sed, quantum scimus, antea non cum myopathiis nemalinis coniunctus est. Functio normalis huius machinationis molecularis requiritur ad reparationem sarcolemmalem post iniuriam et ad fusionem myocytorum nuper formatorum cum myofibris58,61. Ergo, aucta huius processus activitas in utroque coetu aegrotorum responsionem reparativam ad iniuriam ab instabilitate myofibrarum causatam suggerit.
Effectus cuiusque myopathiae nemalinae bene correlati erant (r = 0.736) et rationabilem congruentiam ostenderunt (Figurae Suppletoriae 11A-B), indicantes myopathiam nemalinam ACTA1 et TNNT1 similes effectus in proteoma habere. Nihilominus, quaedam proteina tantum in myopathia nemalina ACTA1 vel TNNT1 regulata sunt (Figurae Suppletoriae 11A et C). Proteina profibrotica MFAP4 una ex proteinis maxime auctis in myopathia nemalina TNNT1 erat, sed in myopathia nemalina ACTA1 immutata mansit. SKIC8, pars complexus PAF1C responsabilis pro regulatione transcriptionis geni HOX, in myopathia nemalina TNNT1 deminuta est, sed in myopathia nemalina ACTA1 non affecta est (Figura Suppletoria 11A). Comparatio directa myopathiae nemalinae ACTA1 et TNNT1 maiores reductiones proteinorum mitochondrialium et incrementa proteinorum systematis immunitatis in myopathia nemalina TNNT1 ostendit (Figura 6G-H et Figurae Supplementariae 11C et 11H-I). Haec data congruunt cum maiori atrophia/dystrophia observata in myopathia nemalina TNNT1 comparata cum myopathia nemalina TNNT1 (Figura 6A), suggerentes myopathiam nemalinam TNNT1 formam graviorem morbi repraesentare.
Ad diiudicandum utrum effectus myopathiae nemalinae observati in gradu totius musculi permaneant, analysin proteomicam in massa biopsiarum musculorum ex eadem cohorte aegrotorum myopathiae nemalinae TNNT1 affectorum perfecimus et eos cum controlibus (n=3 per gregem) comparavimus (Figura Supplementaria 13A, Series Datorum Supplementaria 25). Ut expectatum, controles arcte conexi erant in analysi principalium componentium, dum aegroti myopathiae nemalinae TNNT1 affecti variabilitatem inter exempla maiorem exhibuerunt, similem ei quae in analysi fibrae singularis visa est (Figura Supplementaria 13B). Analysis in massa proteinas differentiter expressas (Figura Supplementaria 13C, Series Datorum Supplementaria 26) et processus biologicos (Figura Supplementaria 13D, Series Datorum Supplementaria 27) per comparationem fibrarum singularum illustratos reproducit, sed facultatem distinguendi inter genera fibrarum diversa amisit et effectus morbi heterogeneos per fibras in rationem reddere non potuit.
Haec data simul sumpta demonstrant proteomicam singularum myofibrarum posse elucidare proprietates biologicas clinicas quae methodis selectis, ut immunoblotting, non detegi possunt. Praeterea, haec data limitationes usus solae typificationis fibrae actinae (MYH) ad describendam adaptationem phenotypicam illustrant. Re vera, quamquam commutatio typi fibrae inter myopathias nemalinas actinae et troponinae differt, ambae myopathiae nemalinae typificationem fibrae MYH a metabolismo fibrarum musculi sceletalis versus proteoma musculi celeriorem et minus oxidativum disiungunt.
Heterogeneitas cellularis est necessaria ad textus ut suis variis postulationibus satisfaciant. In musculo sceletali, haec saepe describitur ut genera fibrarum variis gradibus vis productionis et lassitudinis insignita. Attamen, manifestum est hoc tantum parvam partem variabilitatis fibrarum musculi sceletalis explicare, quae multo magis variabilis, complexa et multiformis est quam antea putabatur. Progressus technologici nunc lucem attulerunt in factores qui fibras musculi sceletalis regulant. Revera, nostra data suggerunt fibras typi 2X fortasse non esse distinctum subtypum fibrarum musculi sceletalis. Praeterea, proteinas metabolicas, proteinas ribosomales et proteinas cellulis associatas ut determinantes maiores heterogeneitatis fibrarum musculi sceletalis identificavimus. Applicando nostrum fluxum operis proteomicum ad exempla aegrotorum cum myopathia nematodica, ulterius demonstravimus typum fibrarum MYH fundatum heterogeneitatem musculi sceletalis non plene reflectere, praesertim cum systema perturbatur. Revera, cuiuscumque generis fibrae MYH fundatae sint, myopathia nematodica mutationem versus fibras celeriores et minus oxidativas efficit.
Fibrae musculorum sceletalium iam ab saeculo XIX classificatae sunt. Recentes analyses omicae nobis permiserunt ut perfiles expressionis variorum generum fibrarum MYH et responsa earum ad diversa stimuli intellegere inciperemus. Ut hic describitur, modi omici etiam commodum maioris sensibilitatis ad quantificandos indices typi fibrarum habent quam methodi traditionales anticorporibus fundatae, sine fiducia in quantificatione unius (vel paucorum) indices ad definiendum typum fibrae musculorum sceletalium. Usi sumus fluxibus operis transcriptomicis et proteomicis complementariis et integravimus eventus ad examinandam regulationem transcriptionalem et post-transcriptionalem heterogeneitatis fibrarum in fibris musculorum sceletalium humanorum. Hic fluxus operis effecit ut defectus esset in identificandis fibrarum purarum typi 2X in gradu proteini in vasto laterali cohortis nostrae iuvenum sanorum. Hoc congruit cum prioribus studiis singularum fibrarum quae <1% fibrarum purarum 2X in vasto laterali sano invenerunt, quamquam hoc in aliis musculis in futuro confirmari debet. Discrepantia inter detectionem fibrarum 2X fere purarum in gradu mRNA et tantum fibrarum mixtarum 2A/2X in gradu proteini est perplexa. Expressio mRNA isoformae MYH non est circadiana,67 quod suggerit nos verisimiliter signum initii MYH2 in fibris 2X puris apparente in gradu RNA "omisisse". Una explicatio possibilis, quamvis pure hypothetica, potest esse differentiae in stabilitate proteini et/vel mRNA inter isoformas MYH. Re vera, nulla fibra celeris est 100% pura pro ulla isoforma MYH, et incertum est utrum gradus expressionis mRNA MYH1 in ambitu 70-90% aequalem abundantiam MYH1 et MYH2 in gradu proteini efficerent. Attamen, cum totum transcriptoma vel proteoma consideratur, analysis gregum confidenter tantum duos greges distinctos fibras musculorum sceletalium tardas et celeres repraesentantes identificare potest, cuiuscumque sint precisae compositionis MYH. Hoc congruit cum analysibus utentibus methodis transcriptomicis unius nuclei, quae typice tantum duos greges myonucleares distinctos identificant. 68, 69, 70 Praeterea, quamquam studia proteomica priora fibras typi 2X identificaverunt, hae fibrae non separatim a reliquis fibris celeribus congregantur et tantum parvum numerum proteinorum differentialiter abundantium ostendunt, comparatis cum aliis generibus fibrarum in MYH fundatis. 14 Haec eventa suggerunt nos ad opinionem classificationis fibrarum musculorum initio saeculi XX redire debere, quae fibras musculorum sceletalium humanorum non in tres classes distinctas in MYH, sed in duas coetus in proprietatibus metabolicis et contractilibus dividebat. 63
Magis autem interest quod heterogeneitas myofibrarum secundum multiplices dimensiones consideranda est. Studia "omica" priora hanc directionem monstraverunt, suggerentes fibras musculorum sceletalium non formare fasciculos discretos sed secundum continuum dispositas esse. 11, 13, 14, 64, 71 Hic demonstramus, praeter differentias in proprietatibus contractilibus et metabolicis musculi sceletalis, myofibras distingui posse per notas ad interactiones cellularum et mechanismos translationis pertinentes. Revera, heterogeneitatem ribosomatum in fibris musculorum sceletalium invenimus quae ad heterogeneitatem confert, independenter a generibus fibrarum tardarum et velocium. Causa subiacens huius heterogeneitatis myofibrarum substantialis, independenter a genere fibrarum tardarum et velocium, adhuc incerta manet, sed fortasse indicat ordinationem spatialem specializatam intra fasciculos musculorum quae optime respondent viribus et oneribus specificis, 72 communicationem specializatam cellularem vel organo-specificam cum aliis generibus cellularum in microambiente musculi 73, 74, 75 vel differentias in activitate ribosomatum intra singulas myofibras. Sane heteroplasmia ribosomalis, sive per substitutionem paralogam RPL3 et RPL3L sive in gradu 2'O-methylationis rRNA, cum hypertrophia musculi sceletalis consociata esse demonstrata est76,77. Applicationes multi-omicae et spatiales cum characterizatione functionali singularum myofibrarum coniunctae comprehensionem nostram biologiae musculi in gradu multi-omico ulterius promovebunt78.
Proteomata singularum myofibrarum a aegrotis cum myopathiis nemalinis analysata, utilitatem, efficaciam, et applicabilitatem proteomicae singularum myofibrarum ad pathophysiologiam clinicam musculi sceletalis elucidandam demonstravimus. Praeterea, nostrum processum cum analysi proteomica globali comparando, demonstrare potuimus proteomicam singularum myofibrarum eandem profunditatem informationis praebere ac proteomicam textus globalem et hanc profunditatem extendere per rationem heterogeneitatis interfibrarum et typi myofibrarum. Praeter differentias expectatas (quamvis variabiles) in ratione typi fibrarum observatas in myopathiis nemalinis ACTA1 et TNNT1 comparatis cum subiectis sanis,19 etiam remodellationem oxidativam et extracellulariam observavimus independentem a commutatione typi fibrarum a MYH mediata. Fibrosis antea in myopathiis nemalinis TNNT1 relata est.19 Attamen nostra analysis hoc inventum innititur, etiam revelando auctos gradus proteinorum extracellularium secretorum cum tensione conexorum, ut annexinarum, quae in mechanismis reparationis sarcolemmalis implicantur, in myofibris aegrotorum cum myopathiis nemalinis ACTA1 et TNNT1.57,58,59 In conclusione, auctos gradus annexinarum in myofibris aegrotorum cum myopathia nemalinica responsionem cellularem ad reparandas myofibras graviter atrophicas repraesentare possunt.
Quamquam hoc studium maximam analysin unius fibrae totius musculi-omicam hominum hactenus repraesentat, non caret tamen limitationibus. Fibras musculorum sceletalium ex exemplo relative parvo et homogeneo participantium et ex uno musculo (vasto laterali) segregavimus. Quapropter, impossibile est excludere existentiam specificarum populationum fibrarum per typos musculorum et in extremis physiologiae musculorum. Exempli gratia, possibilitatem subgrupis fibrarum ultravelocium (e.g., fibrarum purarum 2X) emergentis in velocibus et/vel athletis roboris valde exercitatis79 vel per periodos inactivitatis muscularis66,80 excludere non possumus. Praeterea, magnitudo exempli participantium limitata nos prohibuit ne differentias sexuum in heterogeneitate fibrarum investigaremus, cum proportiones typorum fibrarum inter viros et feminas differre notae sint. Insuper, analyses transcriptomicas et proteomicas in eisdem fibris musculorum vel exemplis ex eisdem participantibus facere non potuimus. Dum nos aliique analyses singulorum cellularum et singulorum myofibrarum optimizare pergimus, utens analysi omica, ad minimum exempli input assequendum (ut hic in analysi fibrarum aegrotorum cum myopathia mitochondriali demonstratum est), opportunitas combinandi modos multi-omicos (et functionales) intra singulas fibras musculorum manifesta fit.
Summa summarum, nostra data factores transcriptionales et post-transcriptionales heterogeneitatis musculi sceletalis identificant et explicant. Praesertim, data proponimus quae dogma vetustum in physiologia musculi sceletalis, cum definitione classica MYH fundata generum fibrarum coniunctum, impugnant. Speramus disputationem renovare et tandem nostram comprehensionem classificationis et heterogeneitatis fibrarum musculi sceletalis retractare.
Quattuordecim participes Caucasici (duodecim viri et duae feminae) sponte consenserunt ut in hoc studio participarent. Studium a Commissione Ethica Nosocomii Universitatis Gandavensis (BC-10237) approbatum est, Declarationi Helsingiensi anni 2013 obtemperavit, et apud ClinicalTrials.gov (NCT05131555) registratum est. Notae generales participantium in Tabula Supplementi 1 exhibentur. Post consensum informatum verbalem et scriptum obtentum, participes examen medicum subierunt ante inclusionem finalem in studio. Participes erant iuvenes (22-42 annos nati), sani (nullae condiciones medicae, nulla historia fumationis), et moderate activi physice. Maxima absorptio oxygenii determinata est utens ergometro graduali ad aptitudinem physicam aestimandam, ut antea descriptum est. 81
Exempla biopsiae musculorum quiescentes et ieiuni ter collecta sunt, quattuordecim diebus inter se distantibus. Quia haec exempla collecta sunt ut pars studii maioris, participes placebo (lactosum), antagonistam receptoris H1 (540 mg fexofenadini), vel antagonistam receptoris H2 (40 mg famotidini) quadraginta minutis ante biopsiam consumpserunt. Ante demonstravimus hos antagonistas receptoris histamini non afficere quiescentem aptitudinem musculi sceletalis81, et nulla congregatio secundum statum in nostris graphicis qualitatis observata est (Figurae Supplementares 3 et 6). Diaeta normata (41.4 kcal/kg ponderis corporis, 5.1 g/kg ponderis corporis carbohydratorum, 1.4 g/kg ponderis corporis proteinorum, et 1.6 g/kg ponderis corporis adipis) per quadraginta octo horas ante singulos dies experimentales servata est, et ientaculum normatum (1.5 g/kg ponderis corporis carbohydratorum) mane diei experimentalis consumptum est. Sub anaesthesia locali (0.5 ml 1% lidocaini sine epinephrino), biopsiae musculorum ex musculo vasto laterali per aspirationem percutaneam Bergström obtentae sunt.82 Exempla musculorum statim in RNAlater inclusa et ad 4°C conservata sunt usque ad dissectionem manualem fibrarum (usque ad 3 dies).
Fasciculi myofibrarum recens isolati in medium RNAlater recens in patina culturae translati sunt. Deinde singulae myofibrae manu dissectae sunt, stereomicroscopio et forcipe subtili utentes. Viginti quinque fibrae ex unaquaque biopsia dissectae sunt, speciali attentione ad fibras ex diversis partibus biopsiae selectas. Post dissectionem, unaquaeque fibra leniter in 3 μl liquoris lysis buffer (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) continentis enzyma proteinasem K et DNasem immersa est ad proteinas et DNA non desiderata removenda. Lysis cellularis et remotio proteinorum/DNA deinde initiatae sunt per breve vorticationem, rotationem liquidi in microcentrifuga, et incubationem ad temperaturam ambientem (10 min). Lysatum deinde in cyclatore thermali (T100, Bio-Rad) ad 37°C per 5 min, 75°C per 5 min incubatum est, et statim ad -80°C usque ad ulteriorem processum conservatum.
Bibliothecae RNA polyadenylatae Illumina-compatibiles ex 2 µl lysati myofibrae praeparatae sunt utens QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Methodi detalladae in manuali fabricatoris inveniri possunt. Processus incipit cum synthesi cDNA primi filamenti per transcriptionem inversam, quo tempore identificatores moleculares singulares (UMIs) et codices i1 specifici exemplorum introducuntur ut collectionem exemplorum curentur et variabilitatem technicam per processum subsequentem minuant. cDNA ex 96 myofibris deinde colligitur et cum globulis magneticis purificatur, post quod RNA removetur et synthesis secundi filamenti perficitur utens inicibus fortuitis. Bibliotheca cum globulis magneticis purificatur, notae i5/i7 specificae gregis adduntur, et PCR amplificatur. Gradus purificationis finalis bibliothecas Illumina-compatibiles producit. Qualitas cuiusque gregis bibliothecae aestimata est utens High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Secundum quantificationem Qubit, aggregata ulterius in concentrationibus aequimolaribus (2 nM) congregata sunt. Agregatum inde resultans in instrumento NovaSeq 6000 modo normali sequentiatum est, utens NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 nucleotidis) cum onere 2 nM (4% PhiX).
Series nostra in serie analysis datorum QuantSeq Pool Lexogen fundatur (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Data primum demultiplexata sunt cum bcl2fastq2 (v2.20.0) secundum indicem i7/i5. Lectio 2 deinde demultiplexata est cum idemux (v0.1.6) secundum codicem i1 et sequentiae UMI extractae sunt cum umi_tools (v1.0.1). Lectiones deinde cum cutadapt (v3.4) multis vicibus resecatae sunt ut lectiones breves (<20 longitudinis) vel lectiones solum ex sequentiis adaptoribus constantes removerentur. Lectiones deinde cum genoma humano ordinatae sunt utens STAR (v2.6.0c) et fasciculi BAM indicati sunt cum SAMtools (v1.11). Lectiones duplicatae remotae sunt utens umi_tools (v1.0.1). Denique numeratio ordinationum per featureCounts in Subread (v2.0.3) peracta est. Qualitas inspectio per FastQC (v0.11.9) in pluribus stadiis intermediis processus peracta est.
Omnes ulteriores processus et visualisatio bioinformatica in R (v4.2.3) peractae sunt, imprimis per fluxum laboris Seurat (v4.4.0) utentes.83 Ergo, valores UMI singuli et matrices metadatarum in obiecta Seurat transformatae sunt. Gena in minus quam 30% omnium fibrarum expressa sublata sunt. Exempla qualitatis inferioris sublata sunt secundum limen minimum 1000 valorum UMI et 1000 genorum detectorum. Tandem, 925 fibrae omnes gradus filtrationis qualitatis superaverunt. Valores UMI normalizati sunt utens methodo Seurat SCTransform v2,84 omnes 7418 notas detectas includentes, et differentiae inter participes regressae sunt. Omnes metadatae pertinentes in Dataset Supplementario 28 inveniri possunt.
Tempus publicationis: X Septembris, MMXXXV